Laba-laba serigala merupakan makhluk soliter yang biasanya berkeliaran sendirian di malam hari, untuk mengintai mangsanya. Menurut Sewlal, mereka “kebanyakan aktif di malam hari dan sering disalahartikan sebagai tarantula.” Menurut Departemen Konservasi Missouri, mereka biasanya hidup di tanah, meskipun beberapa diketahui memanjat pohon untuk menangkap mangsanya. Beberapa spesies bersembunyi di vegetasi atau serasah daun, sementara yang lain menggali terowongan atau menggunakan terowongan hewan lain. Beberapa laba-laba serigala berburu di wilayah tertentu dan kembali ke tempat tertentu untuk mencari makan, sementara yang lain berkeliaran secara nomaden tanpa wilayah atau rumah.
Laba-laba serigala memakan sebagian besar serangga yang tinggal di tanah dan laba-laba lainnya. Terutama betina besar dapat memakan vertebrata kecil, menurut BioKids. Beberapa spesies mengejar dan mengambil mangsanya, sementara yang lain menunggunya lewat dan menyergapnya. Laba-laba serigala sering melompat ke mangsanya, menahannya di antara kaki mereka dan berguling di punggungnya, menjebak mangsanya dengan anggota tubuhnya sebelum menggigitnya.
Laba-laba serigala menggunakan penglihatan mereka yang tajam, pewarnaan kamuflase, gerakan cepat dan kepekaan tinggi terhadap getaran untuk waspada dan tetap aman dari pemangsa. Mereka akan menggigit saat terancam. Namun, menurut Departemen Konservasi Universitas Michigan, laba-laba serigala juga merupakan sumber makanan penting bagi kadal, burung, dan beberapa hewan pengerat.
Laba-laba serigala adalah pelari cepat dari dunia laba-laba. Sebagian besar dari ribuan spesies dalam keluarga ini tidak membuat jaring; sebaliknya, mereka mengejar dan menerkam mangsa serangga mereka seperti serigala yang menginspirasi nama mereka.
Begitu laba-laba serigala menangkap mangsanya, mereka akan menumbuknya menjadi bola atau menyuntikkan racun ke dalamnya, mencairkan organ dalam menjadi smoothie laba-laba serigala.
Semua laba-laba serigala memiliki delapan mata gelap yang diatur di sekitar kepala mereka, atau cephalothorax. Dua mata besar bersinar dari atas kepala; dua mata besar lainnya mengintip dari depan; dan empat mata yang lebih kecil membentuk barisan tepat di atas mulut laba-laba.
Kebanyakan laba-laba serigala menghabiskan waktu mereka di tanah. Warna gelap dan berbintik-bintik pada tubuh mereka membantu mereka berbaur dengan materi tanaman yang membusuk saat berburu atau menghindari pemangsa. Terkadang mereka menggali liang atau membuat lubang di bawah batu atau batang kayu untuk ditinggali.
Laba-laba serigala telah menemukan cara untuk hidup di mana saja. Sementara beberapa spesies ditemukan di puncak gunung yang dingin dan berbatu, yang lain hidup di tabung lava vulkanik. Dari gurun hingga hutan hujan, padang rumput hingga halaman rumput pinggiran kota, laba-laba serigala tumbuh subur; kemungkinan ada satu di dekatnya. Satu spesies bahkan ditemukan hidup di tanaman gandum, memakan hama seperti kutu daun.
Saat waktunya kawin, laba-laba serigala jantan menarik perhatian betina dengan mengayunkan bagian mulutnya yang panjang (palp) secara berirama atau memukul-mukulnya di atas daun. Setelah kawin, betina memutar kantung telur bundar, menempelkannya ke perutnya dan membawanya kemana-mana. Anak-anak menetas di dalam, kemudian muncul dan naik ke punggung ibu sampai mereka cukup besar untuk hidup sendiri.
Banyak spesies dianggap memiliki populasi yang stabil. Tetapi beberapa, seperti laba-laba serigala desertas dari Portugal dan laba-laba gua Kaua'i di Hawaii, terancam punah.